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研究背景高三尖杉碱酯（HOMOHARRINGTONINE，CEPHALOTAXINE，4METHYL2HYDROXY4METHYLPENTYLBUTANEDIOATEESTER，简称HHT，别名高粗榧碱）是从我国特有三尖杉属植物海南粗榧（CEPHALOTAXUSHARRINGTONIA）（常绿乔木）中分离得到的天然生物碱，在纳摩尔（NANOMOLARCONCENTRATION，NM）浓度就能杀伤肿瘤细胞，是一种非常有效的抗癌剂。在中国，HHT被用来作为急性髓系白血病ACUTEMYELOIDLEUKEMIA,AML联合化疗方案的一个关键组成部分，广泛使用已经超过30年。最近的一项多中心、开放、随机对照的Ⅲ期临床试验显示，对于原发性AML患者，基于HHT的诱导方案HAA（高三尖杉酯碱阿糖胞苷阿柔比星）取得了较高73％的完全缓解率COMPLETEREMISSIONRATE，CR，显着高于目前治疗AML的国际标准方案（柔红霉素联合阿糖胞苷）的573％并且其3年无事件生存率3YEAREVENTFREESURVIVAL为354％比231％，从而成为原发性AML的标准诱导缓解方案。然而，临床上不同白血病患者对HHT的治疗反应是迥然不同的。HHT对部分患者有良好的治疗效果，能达到完全缓解，但也有一部分患者不但没有收到疗效，甚至出现了骨髓抑制等严重后果。因此，寻找HHT抗白血病作用的分子靶标，并阐明其作用的具体分子机制无疑有助于最大限度发挥HHT抗白血病作用并减少HHT相关的毒副作用。以往一些研究认为核糖体是HHT介导的蛋白质翻译抑制的候选靶标之一，其主要依据是晶体结构研究。该研究显示HHT与氨基酸侧链的氨酰基TRNA相竞争，结合在核糖体的肽基转移酶中心的A位。然而，在此共结晶结构模型中使用的HHT浓度为1毫摩尔MM，这是HHT用于杀伤肿瘤细胞NM浓度的10万倍，提示HHT结合到核糖体的亲和力可能不高。不排除在这一高浓度下，HHT非特异性结合到核糖体的可能。此外，如果核糖体是HHT的一个关键靶标，HHT处理后应抑制全部蛋白质的合成。然而，文献研究发现HHT选择性地抑制一些半衰期短的致癌蛋白的合成，如CMYC，CYCLIND1，MCL1等，但对管家基因编码的蛋白质，如GAPDH和ΒACTIN并没有明显影响，这是核糖体作为HHT的主要靶分子所不能解释的。因此，我们推测尚有未知的关键的分子靶标可能参与HHT介导的抗肿瘤活性。文献报道指出，线EEUKARYOTICTRANSLATIONINITIATIONFACTOR4E，EIF4E在具有短半衰期的致癌蛋白或者促生存蛋白的MRNAS转运过程中发挥了关键性的作用并且在AMLM5患者中EIF4E过表达。巧合的是，我们最近的研究发现PEIF4E水平在AMLM5患者中高度上调。结合既往的研究结果，使我们有理由相信HHT可能通过作用于PEIF4E发挥抑制白血病细胞增殖的作用。本研究中，我们首先应用生物素标记的HHT分离和鉴定可能与HHT作用的EIF4E和PEIF4E蛋白质分子靶标，然后通过系列体外和小鼠体内实验手段和方法系统研究HHT与其靶标之间相互作用的分子机制，为明确HHT临床应用的适应症提供科学理论依据。研究目的1、分离和鉴定高三尖杉碱酯抗急性髓系白血病作用的分子靶标2、初步阐明高三尖杉碱酯与其分子靶标PEIF4E相互作用的分子机制3、明确高三尖杉碱酯对高表达分子靶标PEIF4E的人急性髓系白血病细胞在小鼠体内的生长抑制作用4、明确高三尖杉碱酯分子靶标PEIF4E在人髓系白血病原代样本及正常血细胞样本中的表达情况。研究内容与结果1PEIF4E是HHT抗急性髓系白血病活性的一个关键靶标为了明确HHT是否特异性地影响AML细胞中的PEIF4E水平，通过WESTERNBLOTTING检测HHT对PEIF4E和TEIF4E的作用。用HHT处理AMLM5细胞系THP1白血病细胞24小时导致PEIF4E水平的抑制，呈剂量依赖，而TEIF4E水平则不受影响。同样，在原代AML细胞中也观察到了类似结果。并且HHT对PEIF4E水平的影响呈时间依赖。为观察HHT是否存在抑制其他信号分子的脱靶效应，我们检测HHT对MNK1和MCL1的抑制作用。在显着抑制EIF4E磷酸化的浓度，HHT对磷酸化的MNK1没有明显的影响，而MCL1的水平则表现出与PEIF4E平行的下降，表明PEIF4E水平的下降不是非特异性毒性作用的结果。上述结果有力地表明HHT特异性地降低PEIF4E及其下游靶蛋白MCL1。为了评估HHT介导的PEIF4E的减少是否与其抗白血病活性有关，通过MTT试验和WESTERNBLOTTING技术来研究细胞存活率和PEIF4E蛋白下降的关系。我们用一定浓度的HHT作用THP1细胞48小时，可以观察到HHT介导的抗白血病活性和PEIF4E抑制呈正相关，相关系数为087。为了进一步证实上述结果，接下来我们选择了6个具有不同的抑制细胞增殖能力的HHT结构类似物，分别检测其在THP1细胞的抗增殖活性和PEIF4E的抑制作用，发现HHT类似物抗细胞增殖的IC50值和PEIF4E的抑制是显着相关的，相关系数为098。这些结果强有力地说明HHT可能是抑制白血病细胞生长的特异的PEIF4E的拮抗剂。2HHT特异性下调白血病细胞PEIF4E水平为了确认上述实验结果，我们采用生物素标记的HHTHHTBIOTIN来捕获白血病细胞中的PEIF4E蛋白和EIF4E蛋白。采用THP1细胞的全细胞裂解产物与HHTBIOTIN孵育，然后用亲和素磁珠来沉淀与HHTBIOTIN相互作用的蛋白分子复合物。经过充分的洗涤，在沉淀产物中检测到PEIF4E和TEIF4E。与此相一致的是，我们通过SDSPAGE和考马斯亮蓝染色实验检测到PEIF4E蛋白条带，并通过WESTERNBLOTTING和蛋白质谱分析MASSSPECTROSCOPICANALYSIS得到确认。为了检测纯化的PEIF4E蛋白是否与HHT相互作用，进一步通过PULLDOWN实验证实HHTBIOTIN是结合到PEIF4E蛋白的。为了揭示在白血病细胞中HHT结合PEIF4E的细胞定位，用生物素标记的HHTHHTBIOTIN、生物素BIOTIN和HHT作用THP1细胞12小时，通过PEIF4E抗体的免疫荧光染色，观察其与HHTBIOTIN的共定位情况。结果显示HHTBIOTIN在整个细胞浆和细胞核内均有分布，但主要定位于核PEIF4E。为了进一步验证上述实验结果，我们用HHT100NG/ML作用THP1细胞12H或者24H，通过免疫荧光染色来评估PEIF4E和TEIF4E在白血病细胞的分布。结果显示HHT作用12小时，核PEIF4E水平大大减少，在24小时基本消失，但TEIF4E无明显影响。并且我们还观察到，伴随核PEIF4E的消失，HHT促进核PEIF4E在细胞核周边和胞浆的聚集。WESTERNBLOTTING实验也显示HHT作用能显着降低THP1细胞核PEIF4E水平。这些研究结果表明，在白血病细胞，HHT主要结合于PEIF4E，特别是核PEIF4E。3PEIF4E209位磷酸化丝氨酸是HHT结合的关键位点之一为了揭示HHT结合PEIF4E的潜在结合位点，通过计算机分子对接模型，我们发现201AA到212AA是HHT结合EIF4E的关键位点。我们模拟了25纳秒NS时磷酸化S209PEIF4E、磷酸化S209敲除EIF4EΔ209S与HHT的相互作用，结果显示为了获得更强的蛋白配体相互作用，PEIF4E中的环区移向HHT分子，K206的重要组成部分氧原子与HHT分子形成氢键。另一方面，在EIF4EΔ209S内的环区因为局部螺旋的形成而失去其灵活性，因此它与HHT分子的结合力是比较弱的。这可以通过检查环区与HHT的最小距离来进一步说明。模拟PEIF4E、EIF4E和EIF4EΔ209S在025NS与HHT的相互作用，我们发现这个环区是灵活的，并且最终在17NS时PEIF4E与HHT形成紧密而稳定的作用，两者的最小距离为28A然而对于EIF4EΔ209S的模拟显示，该环区始终远离HHT分子，距离达到8A对于EIF4E，也没有观察到其与HHT稳定的相互作用。上述分子对接模型结果表明，相比于EIF4EΔ209S和EIF4E，PEIF4E蛋白对HHT具有更大的亲和力。为了鉴定HHT结合EIF4E的具体氨基酸位点，我们构建了一系列EIF4E的突变体，包括W56，W73，W102和SER209缺失的突变体，通过转染HEK293细胞检测HHT结合到这些突变体的能力。选择这些突变体的主要原因是W73与泛素/降解相关，W56和W102涉及帽结合活性，而S209则是其磷酸化位点。结果显示，SER209缺失的突变体消除了EIF4E与HHT的结合，这与上述计算机模拟结果一致，而其他氨基酸残基的突变，包括EIF4E56W，73W和102W缺失，并不影响EIF4E与HHT的结合。这些结果表明磷酸化SER209位点是HHT结合EIF4E的关键，并且PEIF4E与HHT结合的亲和力远高于EIF4E。4HHT通过增加SUMO化促进蛋白酶体依赖的PEIF4E蛋白降解已知EIF4E是小泛素化蛋白SUMO底物之一。为明确SUMO化修饰是否参与HHT介导的PEIF4E的下降，我们评估了白血病细胞中HHT对PEIF4E和SUMO结合酶UBC9的影响。结果显示，HHT处理THP1细胞3小时，PEIF4E从细胞裂解液的上清转移到不溶性颗粒，伴随出现UBC9的增加。HHT处理24小时后，大部分的PEIF4E从上清液转移到不溶性颗粒，提示HHT增加PEIF4E在髓系白血病细胞中的变性水平。这些结果与免疫荧光观察到的结果即HHT诱导PEIF4E在细胞核周边和胞浆的聚集相一致。进一步，我们发现蛋白酶体抑制剂MG132强烈阻止白血病细胞中HHT诱导的PEIF4E蛋白水平的下降，提示HHT可能触发PEIF4E的蛋白酶体依赖的降解。接下来我们研究HHT是否通过增加SUMO化使PEIF4E变性使用HEK293细胞转染表达FALGEIF4E、FALGEIF4EΔ209S的质粒，然后用/不用HHT处理12H。细胞裂解物用抗FALGM2磁珠进行免疫沉淀，随后用ANTISUMO1、ANTISUMO2/3或者ANTIFALG抗体通过WESTERNBLOTTING技术进行分析。结果显示HHT处理后，用ANTISUMO2/3抗体检测，发现野生型EIF4E在25KDA以上有多条条带，但是在EIF4EΔ209S突变却未检测到而且无法用ANTISUMO1抗体检测到上述条带，并且HHT100NG/ML增加了SUMO化PEIF4E的寡聚化。这些结果表明HHT处理增加了SUMO2/3介导的PEIF4E的SUMO化。此外，SER209的磷酸化是HHT介导的PEIF4E的SUMO化的关键。为了进一步明确上述结果，在白血病细胞中，我们对HHT诱导的UBC9结合到PEIF4E的水平做进一步的分析，发现HHT增加UBC9结合到PEIF4E，呈时间依赖。这些结果表明，HHT诱导SUMO2/3分子介导的PEIF4E蛋白的SUMO化，通过增加UBC9与PEIF4E的亲和力，这反过来导致PEIF4E蛋白酶体依赖的降解。因此，我们提出HHT诱导PEIF4E降解的工作模型HHT特异性结合到PEIF4E的201212AA，导致构象变化，这有利于PEIF4E的寡聚化和SUMO化，最终导致蛋白酶体依赖的降解。5HHT对PEIF4E高表达的人AMLM5原位小鼠移植瘤的生长抑制作用为了获得HHT根除PEIF4E高表达的AML细胞的体内证据，我们把表达高水平PEIF4E的THP1细胞注射到NSG小鼠体内，建立了具有侵袭性的人AMLM5原位小鼠模型。每天按05MG或10MG/KG体重的HHT剂量腹腔给药，1天1次，连续14天。经过HHT处理大大降低了白血病负荷，并且生存时间延长，呈现剂量依赖。用高剂量HHT10MG/KG体重可以完全根除小鼠体内的AMLM5细胞，且到80天时所有小鼠仍处于无病生存。这些结果表明HHT结合于PEIF4E，使其具有根除表达高水平PEIF4E的AML的潜能。6PEIF4E在部分AML患者中异常上调，而在正常个体中未见表达或低表达已有文献指出EIF4E在部分白血病患者中是高表达的，但PEIF4E在人急性髓系白血病患者中是否表达目前未见任何报道。因此，我们通过WESTERNBLOTTING技术检测了7例人AML细胞系，16例不同的AML原代样本，20例健康成年捐赠的正常造血细胞样品中的PEIF4E和EIF4E蛋白水平。结果显示7例AML细胞均表达高水平的PEIF4E和EIF4E蛋白，16例原代样本中有13例8125％表达高水平的PEIF4E和EIF4E蛋白，但在20例健康成年中，8例表达低水平的PEIF4E蛋白，12例不表达PEIF4E蛋白。上述结果表明，相比于正常个体，PEIF4E蛋白水平在部分AML患者中是高度上调的。研究结论1PEIF4E是HHT抗急性髓系白血病作用的重要靶标之一2PEIF4E丝氨酸209位磷酸化是HHT结合的关键位点之一3HHT通过增强SUMO化途径促进PEIF4E进行蛋白酶体依赖的降解4HHT能清除原位NSG小鼠模型体内高表达PEIF4E的人急性单核细胞白血病细胞5PEIF4E在部分急性髓系白血病患者原代白血病细胞样本中呈高表达状态。
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